MEDICINA RIGENERATIVA CON CELLULE STAMINALI

(HADSCS) – HUMAN ADIPOSE STEM CELLS WITH ADIPOSE MICROFRACTURED CLUSTERS AND PRESERVED STROMA-VASCULAR FRACTION (SVF)

Quando parliamo di uso di cellule staminali siamo spesso abituati a pensare che una cellula staminale debba spesso differenziarsi (cioè trasformarsi un altro tipo di cellula) per rimpiazzare qualcosa che è stato perso (per esempio in una ferita). Una logica conseguenza di questo vecchio paradigma è quello di pensare che ci sia quasi una logica “farmacologica”, ovvero tante più cellule staminali andrò a mettere in un determinato tessuto e più sarà facile cercare di riparare questo tessuto.

Quello che emerge in data odierna sono diverse “docce fredde”: per prima cosa le cellule staminali adulte sono multipotenti (non si differenziano in maniera terminale, non hanno nessun fenotipo che piacerebbe ottenere in medicina rigenerativa, quindi nessun cardiomiocita efficace, nessun condrocita competente, non vasi competenti, ecc). In secondo luogo, quando si inseriscono milioni di cellule in una sede di danno, in breve tempo se ne trovano molte poche (a dir tanto il 5%, mentre il resto è morto); la vecchia idea si basa sul fatto che in qualche modo queste cellule, inserite in un tessuto sofferente, andassero incontro a morte. Questo ha portato ulteriormente ad incrementare la ricerca scientifica per espandere queste cellule (farle moltiplicare in un ambiente ex-vivo), che di fatto diventano oggetto di quella che gli enti regolatori chiamano un prodotto di terapia medicinale avanzata.

In questi anni ci siamo accorti che siamo difronte ad una realtà molto diversa: nonostante queste condizioni così negative (poche cellule impiantate che sopravvivono nel tessuto sofferente e poche cellule che non si differenziano), esiste pur sempre un minimo e sottile effetto di riparazione (questo viene chiamto effetto paracrino: la cellula staminale tende a riparare il tessuto perché manda dei messaggi istruttivi al tessuto ricevente per cui questa in qualche modo innesta il processo di autoguarigione).

Quindi se noi vogliamo potenziare il processo di guarigione da parte della tipologia di cellule che vogliamo trapiantare, qual è il problema? Fino ad oggi tutte le tecniche che possediamo per recuperare le cellule da un tessuto sono tecniche di manipolazione in quanto utilizzano gli enzimi per dissociare le cellule da qualunque tessuto, che sia tessuto adiposo, midollo osseo o qualunque altra fonte, utilizzano centrifugazioni multiple e ripetute e usano la cottura in vitro; tuto questo distrugge quello che è il micro-ambiente in cui le cellule staminali vivono. Le cellule staminali infatti non “nuotano” nei tessuti, ma si trovano in strutture ben precise, un micro-ambiente chiamato nicchia-vasculo stromale, che è una nanotopografia particolare. Solo in quell’ambiente le cellule riescono a capire il problema di un tessuto e a mandare messaggi opportuni per riparare il tessuto.

Con un device che sfrutta forze meccanice lievi si può processare il lipoaspirato iniziale in cluster più piccoli attraverso dei filtri. L’importante in una processazione di tessuto è salvare la nicchia vascolo-stromale (SVF), che è la stessa in tutti i tessuti: il fatto di parlare di tessuto adiposo è solo una questione di facilità di prelievo. La nicchia da tessuto adiposo è costituito da un cono centrale di adipociti e pre-adipociti circondata da capillari con parete molto spessa: le cellule staminali vivono proprio là dentro, non nuotano nei tessuti e sono essenzialmente periciti e cellule mesenchimali. Ad oggi, alcuni studiosi non li considerano cellule staminali mentre altri le ritengono anche precursori fenotipici delle stesse cellule staminali, ma in realtà si scambiano continuamente queste caratteristiche, questi due tipi di cellule.

La cosa interessante è che questa struttura tessutale particolare mantiene la crioconservazione, cioè non perde lo status di tessuto. Infatti dopo congelamento in azoto liquido e scongelamento, la nicchia rimane mutata e contiene al suo interno sempre periciti e cellule mesenchimali.

Il tessuto adiposo microfratturato con preservazione della nicchia vasculo-stromale è:

  • prodotto tessutale autologo minimamente manipolato
  • contiene la vera struttura in cui vivono le cellule staminali
  • consiste in un trapianto di tessuto le cui proprietà rimangono inalterate a seguito a crioconservazione
  • ha proprietà tollerogeniche che aprono la strada a studi su ampia scala verso un trapianto allogenico senza rigetto
  • volendo può anche essere espanso in coltura
  • ha un potenziale differenziativo di vasta scala
  • possiede potenzialità di differenziamento vascolare altamente modulabile
  • può essere modulato da energie fisiche
  • può essere utilizzato nei più svariati ambiti clinici di medicina rigenerativa

ANTIBIOTIC EFFECT

In tutti i casi ambulatoriali e non effettuati con l’innesto di hADSCs e di tessuto adiposo micronizzato non si è mai registrato un caso d’infezione. Attualmente i ricercatori stanno indangando su un possibile effetto antibioticio rilasciato dalle hADSCs: sembrerebbe che le cellule staminali da tessuto adiposo secernono un peptide antimicrobico denominato HCAP-18/LL37. L’idea più prossima è quella di dimostrare che la processazione del grasso senza la centrifugazione ma con dispositivi biomedicali di ultima generazione possa in qualche modo attivare meccanicamente queste cellule, cioè lo stimolo fisico che subiscono durante il lavaggio e la riduzione di volume porta a meccanismi intracellulari di attivazione genica e conseguente rilascio di alcune molecole, tra cui il peptide HCAP-18/LL37.

EMA – FDA – CURRENT LEGISLATIONS

Sull’aspetto normativo dell’utilizzo delle cellule staminali si assiste a questi due fenomeni: EMA (European Medicines Agency) ed FDA (Food and Drug Administration) che avevano notevole differenza sulla concezione nella cellula staminale e sulle modalità di conservazione delle stesse, oggi presentano più o meno le stesse norme, norme che però sono in continua evoluzione, tant’è che non si parla più di GMP ma di cGMP, per dire che è una normativa in continua evoluzione e che rende sostanzialmente difficilissimo poter affermare oggi qualcosa ed avere la garanzia che il mese dopo sia ancora così.

In questo nuovo ed innovativo dispositivo di riduzione del tessuto adiposo siamo difronte non tanto a cellule staminali ma ad un tessuto tridimensionale che le contiene; ciò esula dalle normative, cioè non è un ATMP (Advanced Therapy Medicinal Products), cioè un prodotto medicinale di terapia avanzata, non richiede il GMP. Ciò non accade per una cellula staminale espansa, cioè coltivata in vitro: infatti viene considerata sottoposta a manipolazione maggiore e la cell-factory (banca dei tessuti) deve provvedere ad espandere le cellule, a congelarle e a fornirle in ultimo step al chirurgo. La riduzione dei cluster adipocitari, mantenendo la struttura tridimensionale, è tecnicamente un trapianto di tessuto adiposo e non di cellule staminali adulte, il che può benissimo essere effettuato sottoforma di lipofilling, attuato sin dal 1985 ad oggi.

L’altra differenza sostanziale dal punto di vista normativo è che dall’anno scorso (anno 2013) le cellule staminali non sono prodotti di terapia consolidabile: vuol dire che è vietato l’uso compassionevole, non possono essere utilizzate. L’uso compassionevole riguarda solo per un farmaco già applicato per un determinato uso che viene utilizzato per altri usi.

Ma quello che voglio sottolineare è che non sono farmaci! Un conto è una terapia biologica, un conto è una terapia farmacologica. Il fatto stesso che mettano nei criteri di validazione di un prodotto di una cellula il numero di cellule e la dose minima efficace è pura follia, queste sono persone che hanno studiato poco e che avrebbero tornare sui libri di biologia e vedere questa doccia fredda di cui vi parlavo: cioè di tante cellule messe non ne rimane quasi nessuna, quindi non è un problema di dose-tempo, non è un problema di quante cellule inserisco!

Con questo tipo di strategia tessutale con cluster adiposi micro-fratturati e preservazione della nicchia vasculo-stromale la cell-factory siamo noi, le cellule si espandono all’interno del nostro organismo e quindi è completamente diverso proprio perché vivono in un tessuto che viene trapiantato, quindi vi è consentito l’uso compassionevole, può andare nelle banche che non hanno necessitò del cGMP ed è consentito il bancaggio autologo per legge.

La tecnica tradizionale utilizzata fino ad oggi, per quanto riguarda la processazione di tessuto adiposo, prevede la centrifugazione: ciò ha due aspetti fortemente limitativi; in primo luogo, la forza meccanica della centrifugazione uccide una buona percentuale di cellule staminali contenute all’interno delle siringhe; in secondo luogo la separazione e lo scarto dei materiali pro-infiammatori (olio) viene fortemente limitata, sia perché la forze meccanica riesce solo in parte a separare il liquido, sia perché la sua successiva eliminazione è operatore-manuale, quindi non standardizzabile.

La cellula staminale stessa non ripara direttamente il tessuto, ma sono i fattori trofici secreti da queste cellule che tendono ad agire sul tessuto ricevente. Allora la domanda classica è: una volta identificati questi fattori non è possibile iniettare solo queste citochine per poi riparare il tessuto anche in assenza del trapianto delle cellule staminali? La risposta è no! Perché sicuramente la nicchia è una sorta di “laboratorio di biologia molecolare” che viene messo in piazza stabile in un tessuto sofferente.

THE NICHE THEORY FOR FAT GRAFT SURVIVAL (TISSUE ENGINEERING)

Fino a poco tempo fa il tessuto adiporo prelevato dal paziente (lipoaspirato) veniva centrifugato e re-introdotto all’interno dello stesso paziente ma in un sito tissutale ricevente diverso oppure veniva inviato a una banca tessutale, dove veniva digerito con enzimi e collagenasi per estrarre dalla nicchia vascolo-stromale (SVF) la singola cellula staminale derivata da tessuto adiposo. Questa procedura, oltre a distruggere l’ambiente fondamentale per la sopravvivenza di queste cellule in vivo, danneggia gravemente il “glicocalice” della cellula, ovvero un’insieme di antenne che consentono alla staminali di captare il tipo di tessuto in cui vengono trapiantate e quale tipo d’infiammazione andare a spegnere. Una volta isolata la singola staminale, veniva fatta moltiplicare con stimoli e terreni di coltura particolari in modo da ottenere anche diversi tipi di tessuto mesenchimale da re-introdurre nel paziente in un secondo tempo chirurgico.

Tutto questo oggi va a perdere il proprio razionale, soprattutto perché il mantenimento della SVF è essenziuale per una risposta riparativa concreta, e dal punto di vista dell’ingegneria tissutale le cellule staminali con SVF, introdotte in un semplice terreno di coltura, provvedono da sole alla propria replicazione.

STEM CELLS

L’utilizzo delle cellule staminali embrionali ha creato accesi di battiti a livello bioetico, perché è chiaro che qualsiasi sperimentazione su tali cellule riguarda da vicino l’origine della vita: infatti molto spesso l’estrazione di cellule staminali dall’embrione provoca la distruzione e la morte dell’embrione stesso; dall’altro lato invece troviamo la clonazione riproduttiva, con tutte le sue riserve di sicurezza che hanno limitato l’applicazione della clonazione terapeutica in attesa di una maggiore chiarezza di informazione e di dati scientifici totalmente tranquillizzanti. Non si dimentichi inoltre che le cellule staminali embrionali vengono utilizzate per la realizzazione di organismi geneticamente modificati, che possono far comprendere tuttavia alcune patologie su base genetica.

La medicina rigenerativa si base invece sull’utilizzo di cellule staminali adulte, quindi è una medicina sicura, è una medicina che riapre le speranze di cura per quelle numerose patologie ad oggi destinate a lunghi trattamenti farmacologici con limitata efficacia e numerosi effetti collaterali, è una medicina che in un futuro non così lontano potrà sostituire il trapianto d’organo, è una medicina che rispetta i principi bioetici, non provoca la morte di nessun embrione, non favorisce la clonazione.

Tra le cellule staminali di tipo adulto, quelle che più vengono più, conosciute sono quelle presenti nel midollo osseo, infatti abbiamo quella della linea ematopoietica, di cui è anni che si sfruttano le loro potenzialità, per esempio nel trapianto del midollo osseo nelle leucemie, nei linfomi.

La scoperta strepitosa degli ultimi anni è che queste cellule sono presenti anche nel tessuto adiposo, e sono presenti in gran numero, ce ne sono addirittura di più che nel midollo osseo percentualmente. La difficoltà  è estrarle, cioè tirarle fuori.

La cosa straordinaria è che queste cellule, estratte e preservate con un device particolare, hanno un enormi vantaggi: uno, è che queste cellule sono quasi ubiquitarie, cioè chiunque di noi ha una quantità minima di tessuto adiposo; due, è abbastanza semplice prelevarle, basta una mini-liposuzione localizzata e quindi totalmente mini-invasiva per prelevare una quantità sicuramente sufficiente a fare una coltivazione di queste cellule, ma anche per averne un numero sufficiente per un uso immediato.

Hanno ottime caratteristiche biologiche, cioè sono cellule che possono ancora differenziarsi in tutti i tessuti, possono essere bancate per usi futuri, quindi uno le preleva a 30 anni e guarisce come guarirebbe a 30 anni e non come guarirebbe a 70 anni quando magari gli si presenta un problema.

Queste cellule costituiscono un prodotto tessutale autologo, ovvero è materiale prelevato e re-iniettato nello stesso paziente, quindi è privo di effetti collaterali, non provoca reazioni allergiche, non è una tecnica dolorosa poiché viene somministrato attraverso micro-punture con un ago-cannula molto sottile.

Sono cellule che sono molto stabili geneticamente, recenti congressi come quello del Dicembre 2012 a Roma e il secondo congresso della Società Internazionale di Chirurgia Plastica Rigenerativa (ISPRES) del Giugno 2013 a Berlino, hanno dimostrato che sono stabili geneticamente anche dopo diverse differenziazioni e questo è importante per la sicurezza che deve essere sempre la prima preoccupazione di chiunque si occupi di questo campo.

REGENERATIVE MEDICINE

Lo scopo della Medicina e Chirurgia Rigenerativa non è quello di rimpiazzare ciò che nel corpo umano non è più in grado di funzionare, ma quello di fornire gli elementi necessari per una sua riparazione in vivo, di inventare sostituti e presidi in grado di fondersi con il corpo umano e di stimolare e sostenere le capacità intrinseche del nostro corpo a rigenerarsi e a guarire da solo.

La Medicina Rigenerativa è un settore interdisciplinare che ha la prospettiva di riparare, sostituire e rigenerare cellule, tessuti e organi al fine di ripristinare alcune funzioni anatomiche, fisiologiche e biochimiche deteriorate per cause differenti (difetti congeniti, malattie, traumi ed invecchiamento).

E’ stato stimato dal Fondo Monetario Internazionale che l’aumento di soli 3 anni della vita media della popolazione mondiale farà lievitare del 50% i costi dei servizi sanitari.

La fonte ideale di cellule staminali per applicazioni cliniche deve idealmente soddisfare i seguenti criteri:

  1.  disponibile in grande quantità
  2.  procedura di prelievo minimamente invasiva
  3.  le cellule prelevate devono potersi differenziare in linee cellulari differenti (es. 
cellule staminali stromali)
  4.  le cellule devono poter essere impiantate in modo sicuro ed efficace, sia come autologhe, che allogeniche

il tessuto adiposo è considerato pertanto la fonte ideale che soddisfa tali criteri.

Il tessuto adiposo è una delle primarie fonti di cellule staminali mesenchimali (hMSC). Indipendentemente dal tessuto di provenienza, esse hanno dimostrato un destino vasculogenico (riparazione vascolare) in vitro e in vivo. Hanno la caratteristica di poter esprimere un insieme di fattori trofici (che concorrono a nutrire la cellula. Senza di essi la cellula muore) secernibili in diverse condizioni ambientali. Tali fattori individuano una peculiarità di tipo paracrino (inviano messaggi da una cellula all’altra al fine di modificare la fisiologia delle cellule circostanti), inducendo risposte angiogenetiche, antiapoptotiche e antifibrotiche.

Le ADSC possono essere indirizzate verso un destino endoteliale, muscolare liscio, condrocitario, ematopoietico, epatocitario, simil-neuronale, osteoblastico, pancreatico, muscolo-scheletrico, miocardico e vascolare.

1 g di tessuto adiposo contiene approssimativamente 5×103 MSCs, circa 500 volte maggiore rispetto ad 1 g di bone marrow (midollo osseo)

Esistono numerosi esempi in letteratura che dimostrano la multipotenza in vitro delle cellule staminali estratte dal tessuto adiposo.
Infatti, le ADSCs sono di origine mesodermica la cui potenziale differenziazione include cellule adipose, osteogeniche, condrogeniche, miogeniche oltre a fibroblasti, tenociti e cardiomiociti.

Altri studi hanno dimostrato anche il potenziale di differenziazione in linee non- mesodermiche, inclusi simil-neuroni, cellule endoteliali, epiteliali, epatociti, cellule pancreatiche ed ematopoietiche.


dr. mattia colli
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